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隨著PROTAC技術(shù)的不斷成熟，目前的PROTAC技術(shù)備受許多公司和資本青睞。首先，PROTAC技術(shù)的先驅(qū)和領(lǐng)軍人物紛紛創(chuàng)立公司，開發(fā)靶向蛋白降解技術(shù)。國外公司有Arvinas、C4 Therapeutics、Kymera Therapeutics、Vividion、Nurix、Oncopia Therapeutics等，國內(nèi)也有海思科、蘇州開拓、海創(chuàng)藥業(yè)都在布局。目前，約有20多個PROTAC進(jìn)行臨床試驗（圖2）。其中，進(jìn)展最快是Arvinas研發(fā)的靶向雌激素受體ER的ARV-471，目前處于臨床三期。

值得注意的是，這些開展臨床試驗的PROTAC都是通過招募兩種類型的E3連接酶，cereblon (CRBN)和von Hippel-Lindau (VHL) E3連接酶。盡管，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了600多種E3連接酶。相比之下，CRBN和VHL是廣泛用于PROTAC的最具代表性的E3連接酶。因為，與其他E3連接酶相比，它們在癌細(xì)胞中異常豐富，并且很容易招募，同時也報道了許多它們的配體。雖然也研究了其他E3連接酶，如細(xì)胞凋亡抑制蛋白(cIAP)和MDM2，但大多數(shù)PROTAC仍然以招募CRBN或VHL為主。

  PROTAC臨床轉(zhuǎn)化面臨的難題  

當(dāng)前，傳統(tǒng)的治療策略大部分是基于“占據(jù)驅(qū)動”作用模式抑制致病靶蛋白的功能，從而發(fā)揮疾病治療作用。不同于傳統(tǒng)的小分子抑制劑和拮抗劑，蛋白降解劑技術(shù)由于其能夠誘導(dǎo)致病靶蛋白的降解，可解決傳統(tǒng)小分子或生物大分子無法解決的難題。與抑制劑和抗體相比，PROTACs的治療效果更持久，因為它們催化和不可逆地清除致癌蛋白。

盡管PROTAC在癌癥治療方面具有突出的特點，但由于結(jié)構(gòu)特性固有的缺陷，它們向臨床試驗的轉(zhuǎn)化停滯不前。

①PROTAC結(jié)構(gòu)中包含至少兩種蛋白質(zhì)配體，因此不可避免地具有超過700 Da的高分子量。此外，它們還具有許多極性化學(xué)鍵，可以增加拓?fù)錁O性表面積(TPSA)。因此，PROTAC分子的高分子量和大TPSA降低了其細(xì)胞通透性，提高了膜轉(zhuǎn)運體的外排速率。

②此外，PROTACs水溶性差，導(dǎo)致其在生物介質(zhì)中的不穩(wěn)定性。PROTACs的低血清穩(wěn)定性和細(xì)胞滲透性影響了它們的PK和生物利用度，最終導(dǎo)致在正常組織中的不良分布和治療失敗。

基于此，有的研究者會考慮通過化學(xué)優(yōu)化PROTAC的結(jié)構(gòu)，來部分減輕它們的劣質(zhì)性能。但是，TPSA與水溶性成正比關(guān)系，因此降低分子極性以增加細(xì)胞通透性會對PROTACs的水溶性和PK性質(zhì)產(chǎn)生不利影響。此外，PROTAC分子的結(jié)構(gòu)優(yōu)化也很耗時耗力，而且由于所有PROTAC分子的理化參數(shù)值不同，適用性較低。此外，大多數(shù)修飾方法只是為了調(diào)節(jié)它們的細(xì)胞滲透性，而不是它們的生物分布。因此，需要使用適當(dāng)?shù)倪f送系統(tǒng)來改善PROTAC這些問題。

  癌癥特異性PROTAC遞送系統(tǒng)的研發(fā)策略  

目前，各種類型的遞送系統(tǒng)，包括有機(jī)/無機(jī)納米顆粒，小分子靶向部分和抗體已被探索作為PROTAC載體（圖3）。它們可以調(diào)節(jié)PROTACs較差的水溶性和細(xì)胞滲透性，調(diào)節(jié)其PK性質(zhì)，并通過被動或主動靶向方法促進(jìn)PROTACs在腫瘤組織中的選擇性定位。

圖3. PROTAC的遞送系統(tǒng)

3.1  基于納米顆粒的被動靶向PROTAC遞送系統(tǒng)

幾十年來，人們設(shè)計和探索了多種具有高生物相容性、生理穩(wěn)定性和多種功能的高分子納米顆粒用于藥物遞送。其中聚乙二醇嵌段共聚物(PEG)與聚(D,L-lactideco-glycolide) (PLGA)是最具代表性的聚合物給藥體系之一，已獲得FDA批準(zhǔn)。

納米顆粒長期以來被用于調(diào)節(jié)水溶性差的藥物PK性質(zhì)。通常，納米顆粒的尺寸比藥物分子大得多，因此一旦藥物裝入納米顆粒，藥物的溶解度就完全取決于納米顆粒的溶解度。此外，納米顆粒還可以為藥物提供更長的血液循環(huán)，因為它們在生理條件下比小藥物分子具有更高的穩(wěn)定性。Genexol®-PM(用聚合膠束配制的紫杉醇)和Doxil®(脂質(zhì)體阿霉素)是納米顆粒調(diào)節(jié)藥物理化性質(zhì)的代表性例子。

腫瘤組織內(nèi)異常多孔的血管結(jié)構(gòu)和淋巴引流不足，增強(qiáng)了納米顆粒在一定尺寸范圍內(nèi)的腫瘤積累，這就是俗稱的增強(qiáng)滲透性和潴留(EPR)或被動靶向效應(yīng)。納米顆粒一旦在腫瘤組織中定位，就可以被癌細(xì)胞通過幾種攝取途徑內(nèi)吞，如微胞吞、網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞、小穴蛋白依賴的內(nèi)吞和網(wǎng)格蛋白/小穴蛋白不依賴的內(nèi)吞等，隨后在細(xì)胞內(nèi)釋放活性藥物。受到納米顆粒的藥物遞送系統(tǒng)成功的啟發(fā)，研究人員也開始研究納米顆粒被應(yīng)用于改善PROTAC的不良理化性質(zhì)。

3.1.1  脂質(zhì)納米顆粒

2021年，Tufts 大學(xué)的xiao bing xu研究團(tuán)隊利用脂質(zhì)納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)遞送與E3連接酶預(yù)融合的BRD4 PROTACs（ARV-771）。ARV-771由BRD4配體和VHL連接酶配體組成。首先，作者在體外優(yōu)先與VHL蛋白融合制備預(yù)融合PROTACs，隨后將它們包裹在80-O14B脂質(zhì)納米顆粒中。當(dāng)該復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后，預(yù)融合PROTACs直接與靶蛋白結(jié)合，降解BRD4蛋白。作者認(rèn)為，預(yù)融合的PROTAC有望通過將三元絡(luò)合物要求的UPS系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為簡單的二元絡(luò)合物系統(tǒng)來提高BRD4的降解效率。此外，脂質(zhì)納米顆粒有助于預(yù)融合的PROTAC內(nèi)化到癌細(xì)胞，從溶酶體中逃逸，并在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)順利發(fā)揮功能（圖4）。

圖4. 納米脂質(zhì)體包裹的預(yù)融合的BRD4 PROTACs的作用機(jī)制

無機(jī)納米顆粒，如二氧化硅、金、氧化鐵和量子點，是PROTAC遞送的其他候選者，可以表現(xiàn)出與有機(jī)納米顆粒不同的特性。與有機(jī)納米顆粒相比，無機(jī)納米顆粒的形態(tài)和尺寸分布可以更精確地控制，并且其剛性結(jié)構(gòu)降低了在脫靶位點發(fā)生不利藥物泄漏的風(fēng)險。金納米顆粒(GNP)由于其生物惰性、完善的表面修飾方法和賦予額外功能的多功能性而被廣泛研究作為藥物載體。

中國藥科大學(xué)wenyuan liu課題組設(shè)計了基于GNP的多頭PROTAC遞送體系(Cer/Pom-PEG@GNP)用于治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)（圖5）。作者將間變淋巴瘤激酶(ALK)結(jié)合彈頭(Cer-PEG-SH)和CRBN E3連接酶受體(Pom-PEG-SH)通過硫醇-金相互作用偶聯(lián)到直徑為~32 nm的GNPs上，制成了ALK降解的PROTACs復(fù)合體（圖5）。作者認(rèn)為，Cer/Pom-PEG@GNPs的多靶頭特征促進(jìn)ALKs和E3連接酶的相互作用，因此表現(xiàn)出比小分子雙功能PROTACs更好的治療效果。此外， GNPs的應(yīng)用不僅可以調(diào)節(jié)PROTAC的PK差，還可以通過EPR效應(yīng)調(diào)節(jié)PROTAC的腫瘤特異性富集。然而，除了金之外，其他無機(jī)納米顆粒尚未用于PROTAC的遞送。

圖5.Cer/Pom-PEG@GNPs的設(shè)計思路

主動靶向策略主要利用靶向配體與癌癥過表達(dá)膜受體的特異性結(jié)合親和力。通過使用活性靶向部分進(jìn)行PROTAC傳遞，可以調(diào)節(jié)PROTAC不良的細(xì)胞滲透性，因為它們是通過促進(jìn)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，而不是通過簡單的跨膜擴(kuò)散途徑內(nèi)化。內(nèi)吞的PROTAC分布在細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而催化POIs的降解。并且，主動靶向部分促進(jìn)共軛PROTACs的癌癥選擇性富集，降低其脫靶傳遞引起的全身毒性。目前，已經(jīng)報道了幾種活性靶向部分用于PROTAC的遞送，它們可以根據(jù)分子結(jié)構(gòu)依次分為小分子、抗體和適配體。

3.2.1 小分子靶向-PROTAC綴合物     

首先是基于小分子靶向單元的PROTAC遞送體系。2021年，西奈山醫(yī)學(xué)院金堅課題組采用小分子葉酸基團(tuán)作為靶向配體進(jìn)行癌選擇性PROTAC遞送（圖6）。葉酸基團(tuán)通過形成酯基與PROTAC分子結(jié)合，這些酯基可被細(xì)胞內(nèi)水解酶裂解。與其他正常組織相比，葉酸受體在各種癌癥(如卵巢癌、乳腺癌、腎癌和結(jié)直腸癌)中高度表達(dá)，因此“葉酸籠子”PROTACs以受體依賴的方式被癌細(xì)胞特異性吸收，并成功介導(dǎo)POI降解。

圖6.基于葉酸小分子-PROTAC的遞送策略

雖然小分子配體可以賦予PROTAC分子一種癌癥特異性的結(jié)合能力，但由于這些配體的分子尺寸太小，不足以有效地調(diào)節(jié)PROTAC分子水溶性差等問題。由于其相對龐大的結(jié)構(gòu)，抗體不僅彌補(bǔ)了偶聯(lián)PROTACs較差的溶解度，而且決定了PK性質(zhì)。除了具有積極的腫瘤靶向性外，抗體通常比小分子配體具有更長的血液半衰期，因此更適合藥物輸送。其中，最成功的案例莫過于ADC藥物。

3.2.2 抗體靶向-PROTAC綴合物   

2020年，Edward W. Tate團(tuán)隊BRD4首次提出了ab-PROTAC概念。作者將BRD4 PROTACs與抗HER2單抗(曲妥珠單抗)結(jié)合，成功構(gòu)建了靶向HER2陽性乳腺癌的Ab-PROTAC，并成功降解了乳腺癌細(xì)胞中的BRD4蛋白（圖7）。由于曲妥珠單抗的特異性靶向性，Ab-PROTAC結(jié)合物表現(xiàn)出強(qiáng)烈的腫瘤攝取，而很少內(nèi)化到HER2陰性的正常細(xì)胞。PROTACs內(nèi)吞癌細(xì)胞后，與曲妥珠單抗之間的酯鍵被水解，釋放出游離的PROTACs，誘導(dǎo)不可逆的BRD4降解。

圖7.基于抗體-PROTAC的遞送策略

3.2.3 核酸適配體-PROTAC綴合物

核酸適配體是核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)為基礎(chǔ)的具有短和單鏈初級結(jié)構(gòu)的靶向部分。由于其高結(jié)合親和力、穩(wěn)定的重復(fù)性和低免疫原性，適配體在分子成像和藥物傳遞方面已被廣泛研究。2021年，海軍軍醫(yī)大學(xué)的盛春泉課題組報道了BRD4 PROTACs和核仁靶向適配體組成的適配體- PROTAC綴合物，可用于乳腺癌的治療。PROTAC通過含有二硫基的短鏈與適配體連接，在谷胱甘肽(GSH)存在下可以被裂解。該適配體- PROTAC結(jié)合物僅對過表達(dá)核仁的癌細(xì)胞具有顯著的BRD4降解活性，有利于調(diào)節(jié)PROTACs較差的溶解度和PK性質(zhì)。此外，適配體- PROTAC綴合物比抗體- PROTAC綴合物更有優(yōu)勢，因為它們具有更高的生理穩(wěn)定性，可以規(guī)避抗體的免疫原性。

圖8. 基于核酸適配體-PROTAC的遞送策略

3.2.4 主動靶向半功能化納米顆粒-PROTAC綴合物

PROTAC與抗體或適配體的直接偶聯(lián)已被證明可以增加PROTACs的腫瘤選擇性積累，并成功地調(diào)節(jié)其不良的PK性質(zhì)。然而，Ab-PROTAC在裝載能力方面存在局限性。研究表明，主動靶向半功能化納米顆?？梢杂米鱌ROTAC載體，并可以顯著改善PROTAC的裝載問題。與抗體相比，納米顆粒在PK中受負(fù)載量的影響較小，因此能夠容納相對大量的PROTAC。此外，具有主動靶向部分的納米顆粒表面修飾可以通過利用被動和主動靶向方法促進(jìn)PROTACs增強(qiáng)腫瘤富集。

2022年，上海藥物所于海軍團(tuán)隊提出了一種基于PROTAC的癌癥聯(lián)合治療的多功能聚合物遞送系統(tǒng)（圖9）。作者設(shè)計了一種自組裝的聚合物納米顆粒，通過生物正交化學(xué)靶向到腫瘤組織，其表面的PEG被TMEs中的基質(zhì)金屬蛋白酶2 (MMP2)裂解。作者將BRD4降解劑（ARV-771或MZ1光敏劑）與谷胱甘肽(GSH)敏感鍵化學(xué)偶聯(lián)到聚合物納米顆粒上。而聚合物納米顆?？梢酝ㄟ^適應(yīng)生物正交化學(xué)和多種刺激敏感策略，使PROTAC和光敏劑高度選擇性地傳遞到腫瘤組織。此外，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)它們被用于乳腺癌模型時，BRD4降解作用和光動力治療(PDT)協(xié)同促進(jìn)了癌細(xì)胞的凋亡，從而實現(xiàn)了有效的腫瘤消退。

圖9. 基于主動靶向半功能化納米顆粒的PROTAC遞送策略